细胞疗法

严重的异种移植物抗宿主病（xeno-GVHD）会缩短细胞治疗的评估窗口期，，影响移植细胞疗法的疗效评估。。。。β2微球蛋白（β2 microglobulin，，，B2M）是MHC I类分子的组成部分
，
，，，广泛表达于有核细胞表面，，，
，参与机体的自身识别和抗微生物免疫反应。。因此，，
，，敲除MHC I类分子的β2微球蛋白（β2m）是一种有效降低GVHD发生风险的策略，，有助于延长细胞治疗的观察窗口并提高评估效率。
。。。

(A) B2M参与MHC I类分子的组成；(B-C) B-NDG B2m KO plus小鼠（蓝线）在植入PBMCs后
，，，，相比于B-NDG小鼠（橙线）表现出更低的GVHD评分和更长的生存时间；(D-E) 在B-NDG B2m KO plus小鼠中进行的CAR-T 体内药效研究，，，，展示了肿瘤体积（D）和体重（E）。。。。

• 将CD19-CAR T细胞或未转染T细胞与靶细胞（Daudi、、Raji、、、K562）以5:1、
  、10:1和20:1的比例共培养24小时。。。。使用可修饰活性染料通过流式细胞术评估肿瘤细胞毒性
  。。。。
• 结果显示，，，与未转染T细胞相比，
  ，，，CD19-CAR T细胞对表达CD19的Daudi和Raji细胞表现出显著的细胞毒性。
  。然而
  ，
  ，CD19-CAR T对不表达CD19的K562细胞没有特异性细胞毒性。。

• 将标记CFSE的CD19-CAR T与靶细胞（Raji
  、
  、
  、
  、K562）以5:1、、
  、10:1和20:1的比例共培养72小时
  。
  。。使用流式细胞术评估CD19-CAR T增殖
  。。。
• 结果显示，
  ，
  ，CD19-CAR T细胞与表达CD19的Raji细胞共培养时表现出显著的增殖
  ，，，，而与不表达CD19的K562细胞共培养时则无显著增殖。。。。

• 将CD19-CAR T与靶细胞（Raji、
  、
  、K562）以5:1、
  、、10:1和20:1的比例共培养24小时。。通过流式细胞术评估CD19-CAR T的CD25和CD69的表达。
  。。
• 结果显示，，，
  ，CD19-CAR T细胞与表达CD19的Raji细胞共培养时
  ，，
  ，，CD25和CD69的表达显著增加，，而与不表达CD19的K562细胞共培养时则未见明显变化。。

• 将CD19-CAR T与靶细胞（Raji、、、K562）以2:1、
  、、5:1和10:1的比例共培养24小时。。。。共培养后，，
  ，收集上清液
  ，，，并通过Bio-Lite Luciferase Assay系统检测IFN-γ和IL-2的分泌。
  。。。
• 结果显示，，，
  ，只有CD19-CAR T + Raji组的IFN-γ和IL-2分泌显著增加，，
  ，，而CD19-CAR T + K562组或未转染组未见显著变化。。

• 从CD19-CAR T或未转染T细胞中提取DNA，，，分别在第10天和第13天收集
  。。。标准和样品板每个孔含有两个重复孔。
  。。绘制标准曲线浓度为10⁵拷贝/µL，，10⁴拷贝/µL，，，10³拷贝/µL
  ，，
  ，10²拷贝/µL和10拷贝/µL。
  。

y轴表示Ct值，，，x轴表示标准拷贝浓度的对数（以10为底）
。。
。。标准曲线的斜率表示实时PCR扩增效率。
。
。。当扩增效率为100%时，，斜率为-3.32。。
。

• 扩增效率E=10^−1/斜率－1，
  ，，实验的扩增效率为85%，，
  ，，我们正在尝试更特异的引物进行进一步实验。
  。